重磅！清華施一公團隊跨年連發(fā)Nature、Science
2018年12月31日和2019年1月10日，西湖大學(xué)校長、清華大學(xué)生命學(xué)院、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心施一公教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊分別于《自然》和《科學(xué)》發(fā)表兩篇長文：《人源γ-分泌酶識別底物Notch的結(jié)構(gòu)機制》、《人源γ-分泌酶底物淀粉樣前體蛋白的識別》，報道了人體γ-分泌酶分別結(jié)合底物Notch以及和淀粉樣前體蛋白（APP）的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。
兩篇論文分別揭示了了結(jié)合兩種不同底物后γ-分泌酶發(fā)生的構(gòu)象變化，并對這些構(gòu)象變化的功能進行了生化研究，為理解γ-分泌酶特異性識別并切割底物的分子機制提供了重要認知基礎(chǔ)，從而為研究與癌癥以及阿爾茲海默癥相關(guān)的特異性藥物設(shè)計提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。
阿爾茲海默癥患者有增無減，γ-分泌酶是藥物開發(fā)的重要靶點
據(jù)這兩篇長文的共同第一作者——清華大學(xué)生命學(xué)院博士后、結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心卓越學(xué)者楊光輝、周瑞介紹，阿爾茲海默癥（AD，俗稱老年癡呆癥）是當今世界面臨的最為嚴峻的神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為腦組織切片中出現(xiàn)淀粉樣斑塊，神經(jīng)元死亡，認知和記憶能力受損，最后腦功能嚴重受損直至死亡。
統(tǒng)計結(jié)果表明，在65歲以上人群中，其發(fā)病率高達10%；在85歲以上人群中，發(fā)病率更是達到30-50%；我國目前罹患該病的人口高達500萬，約占世界患者總數(shù)的四分之一。
更為嚴峻的是，由于世界范圍內(nèi)預(yù)防治療手段不足，缺乏特效藥物，該疾病有發(fā)病年齡提前、發(fā)病人數(shù)增加的趨勢，給病人及家屬造成極大痛苦，也同時為社會帶來沉重負擔(dān)。
兩位博士后指出，阿爾茲海默癥的發(fā)病機理尚不明確。病人腦組織中的淀粉樣斑塊，是由淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）被酶切割產(chǎn)生的短肽聚集而來。在此切割過程中，最關(guān)鍵的蛋白酶是γ-分泌酶。γ-分泌酶由四個跨膜蛋白亞基組成，分別為Presenilin（PS1）、Pen-2、Aph-1和Nicastrin。
“如果把底物Notch或者APP比喻成一根繩子，那么γ-分泌酶的作用就是要把這根繩子剪成一段一段。如果切割產(chǎn)生異常，或者這些剪出來的小段纏繞在一起就有可能導(dǎo)致疾病。在γ-分泌酶的四個組分中，PS1就是那把剪刀”楊光輝說。
淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）被γ-分泌酶切割示意圖
周瑞告訴記者，構(gòu)成PS1蛋白的基因中有200多個突變與AD病人相關(guān)，這些突變有可能導(dǎo)致PS1功能異常而引起阿爾茲海默癥的發(fā)生。此外，除了淀粉樣蛋白，重要的信號蛋白Notch也是γ-分泌酶的底物。Notch的異常切割會導(dǎo)致發(fā)育的異常，與一些諸如T細胞急性淋巴細胞白血病在內(nèi)的癌癥發(fā)病也有重要聯(lián)系?！白鳛榕c阿爾茲海默癥和癌癥均緊密相關(guān)的蛋白，很多藥物的研發(fā)直接以γ-分泌酶作為靶點，希望通過調(diào)節(jié)其活性來治療相關(guān)疾病?！?/span>
γ-分泌酶活性抑制研發(fā)均告失敗，相關(guān)機理研究缺失是主因
“遺憾的是，近年來多種旨在減少淀粉樣沉淀的γ-分泌酶活性抑制劑的臨床實驗均宣告失敗。特別是被寄以厚望的禮來公司研發(fā)的的Semagacestat，也在臨床實驗階段宣告失敗。”兩篇長文的通訊作者施一公教授告訴記者，這些藥物旨在降低γ-分泌酶這把大剪刀對淀粉樣蛋白的切割，從而減少淀粉樣沉淀來治療老年癡呆癥?！芭R床實驗表明，這些抑制劑雖然能夠減少對淀粉樣蛋白的加工，卻并不能改善患者的認知狀況。更嚴重的是，由于抑制劑同時抑制了Notch的加工，使得AD病人罹患癌癥的風(fēng)險大幅增，該臨床實驗不得不提前終止?！?/span>
“究其原因，對γ-分泌酶結(jié)合底物機制研究的缺失是造成失敗的原因之一。”施一公說，理想情況是：這臺蛋白質(zhì)機器只減少對淀粉樣蛋白的加工，而不影響處理其他的原材料?！盀榇耍@得γ-分泌酶與底物Notch以及前體蛋白APP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，對研究γ-分泌酶的底物識別酶切機理和設(shè)計以γ-分泌酶為靶標的特異性藥物，具有極大科學(xué)意義和潛在應(yīng)用價值。”
揭開γ-分泌酶如何識別、剪切底物之謎，為藥物設(shè)計提供潛在靶標
施一公教授2006年在清華大學(xué)建設(shè)實驗室之初，就將揭示阿爾茲海默癥的發(fā)病機理作為重點研究方向，其中一個主要環(huán)節(jié)是解析γ-分泌酶的高分辨率結(jié)構(gòu)，揭示Presenilin突變體的致病機理。經(jīng)過長期不懈的努力，他們自2012年以來取得一系列重要突破。這兩篇文章報道是此前施一公研究組對γ-分泌酶結(jié)構(gòu)與功能系統(tǒng)研究不斷深入的延續(xù)，回答了γ-分泌酶如何識別和剪切底物這一基本問題。
施一公和楊光輝（左）、周瑞
由于酶與底物的“結(jié)合-酶切-解離”這一過程速度極快、轉(zhuǎn)瞬即逝，獲得酶與底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)難度非常大。施一公課題組通過嚴謹?shù)脑O(shè)計和篩選，通過原位交聯(lián)的辦法，成功獲得了γ-分泌酶分別與底物Notch和APP的穩(wěn)定復(fù)合物，并解析了分辨率高達2.7埃和2.6埃(1埃=0.1納米)的結(jié)構(gòu)。
研究結(jié)果顯示，γ-分泌酶與底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中，PS1發(fā)生了較大的構(gòu)象變化。尤為值得一提的是，在跨膜區(qū)靠近細胞內(nèi)的一側(cè)，PS1通過構(gòu)象變化，與底物的胞內(nèi)段形成穩(wěn)定的β-折疊片結(jié)構(gòu)，為穩(wěn)定底物提供了保證。在此狀態(tài)下，底物自身的螺旋結(jié)構(gòu)解開一部分，暴露出被加工的位置。研究組提出了γ-分泌酶結(jié)合底物并依次進行多步酶切的機理：底物的跨膜螺旋隨著加工的進行逐步解旋，被再次加工。
此外，文章還討論了底物進入分泌酶的路徑。
毫無疑問，研發(fā)可以特異地抑制APP的加工而不影響Notch加工的藥物，對于靶向治療阿爾茲海默癥且不導(dǎo)致副作用具有重大價值。研究組通過系統(tǒng)性地在結(jié)構(gòu)當中比較Notch與APP部分被加工區(qū)域的區(qū)別，揭示了研發(fā)這種特異性抑制劑的潛在的結(jié)合位點。有很多與阿爾茲海默癥相關(guān)的突變集中在PS1和APP上，這些突變可能會導(dǎo)致對APP的異常切割。其中一些會發(fā)生多種突變的位點，大多就集中在γ-分泌酶識別APP的位置。研究組通過對結(jié)構(gòu)的詳細分析，分類討論了這些突變可能影響底物結(jié)合的機理。
據(jù)悉，研究組正在研究γ-分泌酶與特異抑制劑的相互作用，期望能為針對老年癡呆的藥物研發(fā)提供更多基礎(chǔ)信息。
γ-分泌酶結(jié)合Notch復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。
a. γ-分泌酶結(jié)合Notch復(fù)合物的密度圖。其中橙色標記的為結(jié)合的Notch；b. γ-分泌酶結(jié)合Notch復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型；c. 底物結(jié)合與不結(jié)合狀態(tài)下催化亞基PS1的結(jié)構(gòu)比較，灰白色為未結(jié)合底物的狀態(tài)，青色和藍色為結(jié)合底物的狀態(tài)，藍色部分為發(fā)生變化的主要區(qū)域；?d.?PS1與底物跨膜區(qū)靠近細胞膜一側(cè)形成β折疊片，從而穩(wěn)定結(jié)合底物；e-f. 與γ-分泌酶結(jié)合后底物Notch發(fā)生的構(gòu)象變化。橙色為結(jié)合在γ-分泌酶中的Notch構(gòu)象，灰白色為未結(jié)合的構(gòu)象。
γ-分泌酶結(jié)合APP復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。
a. γ-分泌酶結(jié)合APP復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型；b. PS1與底物APP所形成的β折疊片結(jié)構(gòu)，其中一個來源于底物，另外兩個片層來源于PS1；c. APP與Notch跨膜區(qū)結(jié)合γ-分泌酶狀態(tài)下表面特征比較，可以觀察到兩種底物的具體區(qū)別；d. APP與γ-分泌酶催化亞基PS1跨膜區(qū)中部分與阿爾茲海默癥相關(guān)突變分布。
